ARCHAEA

Pohon filogenetik untuk Archaea dibuat berdasarkan sekuen gen 16S ribosomal RNA yang membagi Archaea menjadi dua filum yaitu Crenarchaeota dan Euryarchaeota. Pemisahan kedua filum ini didukung oleh analisis genomik.

I. Euryarchaeota

a.                   Ekstrem halofilik

Ekstrem halofilik disebut juga haloarchaea, hidup dilingkungan berkadar garam tinggi. Kata ‘ekstrem halofilik’ ini digunakan untuk indikasi bahwa organisme tersebut bukan hanya halofilik tetapi kebutuhan terhadap garam kadar tinggi (hingga 32%)untuk mendukung kelangsungan hidupnya. Haloferax dan Natronobacterium mampu tumbuh di air laut (2.5% NaCl). Great Salt Lake di Utah merupakan air laut berkonsentrasi garam dan sulfat yang tinggi. Dead Sea relatif mengandung Na⁺ yang rendah dan tinggi ion Magnesium (Mg²⁺).  Soda Lake berkadar karbonat yang tinggi sehingga pH nya tinggi.

Archae disebut juga halobakteri karena genus Halobacterium adalah kelompok pertama yang diklasifikasi dan dapat merepresentasikan Archaea secara umum.  Haloarchaea merupakan bakteri gram negatif, bereproduksi melalui pembelahan biner obligat aerob,dan tidak membentuk spora. Sel berbentuk batang, kokus, atau cup-shaped, dan dinamai Haloquadratum untuk menunjukkan morfologi uniknya, membentuk vesikel, menggunakan asam amino atau asam sebagai sumber energi dan membutuhkan sejumlah growth factor seperti vitamin untuk pertumbuhan optimum.

Archaea ekstrem halofilik membutuhkan ion Natrium dalam jumlah besar untuk pertumbuhannya, terutama dalam bentuk NaCl. Dinding sel Halobacterium tersusun atas glikoprotein dan distabilisasi oleh Na+. Ion Natrium akan berikatan dengan permukaan luar dinding sel Halobacterium dan secara absolut penting untuk mempertahankan integitas sel. Ketika kekurangan Na+, dinding sel akan menghancurkan dan melisiskan sel. Hal ini sebagai konsekuensi akibat tingginya konsentrasi asam amino aspartat dan glutamat dalam glikoprotein pada dinding sel. Muatan negatif pada gugu karboksil berikatan pada Natrium , natrium akan di dilusi sehingga muatan negatif pada protein akan saling tolak-menolak dan sel pun lisis. Protein sitoplasma pada Halobacterium sangat bersifat asam, ion K+ merupakan kation predominan dalam sitoplasma. Komponen sel yang berinteraksi langsung dengan lingkungan luar membutuhkan Na+ tinggi untuk mempertahanan stabilitas,sedangkan kompenen dalam sel membutuhkan K+ tinggi.

Spesies Haloarchaea tertentu dapat mengkatalisis reaksi light-driven synthesis ATP yang terjadi tanpa klorofil sehingga tidak termasuk reaksi fotosintesis. Organisme ini memiliki bacterioruberin. Pada kondisi lingkungan yang rendah aerasi, Halobacterium salinarum dan beberapa haloarchaea mensintesis protein bacteriorhodopsin dan memasukkannya kedalam membran sitoplasma.  Bacteriorhodopsin memiliki kemiripan struktural dan fungsional dengan rhodopsin. Bacteriorhodopsin menyerap cahaya hijau sekitar 570 nm dan mengeksitasi bacteriorhodopsin retina  pada konformasi trans menjadi bentuk cis (Retc). Produksi ATP yang dimediasi oleh bacteriorhodopsin pada H.salinarum mendukung pertumbuhan lambat organisme ini dalam kondisi anoksik. Pompa proton yang distimulasi oleh cahaya pada H.salinarum juga berfungsi untuk memompa Na+ ke luar sel dengan adanya aktivitas sel berupa sistem antiport Na+_H+. Selain bacteriorhodopsin, ada tiga jenis rhodopsin yangterdapat dalam membran sitoplasma H.salinarum, salah satunya yaitu Halorhodopsin (light-driven chloride pump yang membawa Cl- kedalam sel sebagai anion untuk K+).  

b.                  Archaea Metanogenik

Metanogen memproduksi metana sebagai bagian dalam metabolisme energi. Taksonomi metanogenik berdasarkan fenotip dan analisis filogenetik. Sifat kimia dinding sel metanogenik sangat beragam. Dinding pseudomomurein pada spesies Methanobacterium , methanochondroitin pada spesies Metanosarcina, protein / glikoprotein pada Methanocaldococcus, dan layer S pada Methanospirillum. Secara fisiologi, metanogenik merupakan mikroorganisme obligat anaerob, mesofilik dan nonhalofil. Tiga kelompok senyawa yang dapat dijadikan sebagai substrat yaitu CO2_type substrate, methylated substrate,d an asetat. Methanocaldococcus jannaschii  merupakan model organisme metanogenik karena bersiat hipertermofilik.

c.                   Thermoplasmatales

Thermoplasma dan Ferroplasma tidak memiliki dinding sel dan menggunakan mycoplasma. Thermoplasma merupakan mikroorganisme kemoorganotrof yang tumbuh secara optimal pada 55C dan pH 2 dalam medium kompleks, fakultatif aerob. T.volcanicum diisolasi dari hot acidic soil, memiliki flagella.  Membran mengandung lipopolisakarida berupa lipoglikan yang terdiri dari membran monolayer lipid tetraeter dengan manosa dan glukosa, terdapat glikoprotein sehingga Thermoplasma dapat stabil pada kondisi panas dan berasam. Thermoplasma mengandung genome yang relatif kecil (sekitar 1.5 Mbp) dengan DNA sangat kompleks dengan adanya DNA-binding protein yang mengatur DNA kedalam patikel globular pada nukleosom sel eukariot. Protein ini homolog terhadap histon-like DNA-binding protein HU pada bakteri yang memegang peranan penting dalam pengaturan DNA dalam sel. Ferroplasma bersifat kemototrof, asidofilik kuat (bukan termofilik), tumbuh optimum pada 35C. Ferroplasma mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ untuk mendapatkan energi, dan menggunakan CO2 sebagai sumber karbon (autotrof). Picrophilus  tumbuh optimum pada pH 0.7 dan mampu tumbuh pada pH dibawah 0. Picrophilus mempunyai dinding sel berupa layer S dan %GC DNA yang lebih rendah dibandingkan dengan Thermoplasma dan ferroplasma. Fisiologi  Picrophilus dapat dijadikan sebagai model bagi organisme extreme acid tolerance.

d.                  Thermococales dan Methanopyrus

Thermococcus merupakan spherical hyperthermophilic euryarchaeote indigenous yang memiliki flagela polar dan motil, kemoorganotrof anaerob obligat. Pyrococcus tumbuh pada suhu antara 70-106°C dengan suhu optimum 100°C. Protein, pati, atau maltosa di oksidasi sebagai donor elektron, dan S⁰ sebagai akseptor elektron dan direduksi menjadi H₂S. Methanopyrus adalah metanogen hipertermofilik yang di isolasi dari sedimen panas dekat submarine hydrothermal vent dan dari dinding dari ‘black smoker’ hydrothermal vent chimneys. Methanopyrus memiliki lipid membran yang tidak ditemukan pada organisme lain.

e.                   Archaeoglobales

Archaeoglobus diisolasi dari hot marine sediment didekat hydrothermal vent. Archaeglobus melakukan oksidasi H₂, laktat, piruvat, glukosa, atau senyawa organik kompleks; dan reduksi sulfat menjadi H₂S. Selnya kokus irregular dan tumbuh optimum pada 83°C. Ferroglobus merupakan iron-oxidizing chemolithotroph, mendapatkan energi dari oksidasi Fe²⁺ menjadi Fe³⁺ yang diiringi reduksi nitrat menjadi nitrit.Ferroglobus tumbuh secara autotrof ,menggunakan H₂ atau H₂S sebagai donor elektron.Ferroglobus diisolasi dari shallow marine hydrothermal vent dan tumbuh optimal pada 85°C.

f.                   Nanoarchaeum dan Aciduliprofundum

Nanoarchaeum equitans merupakan prokariot yang tidak biasa, hidup sebagai simbion obligat pada Ignicoccus. Aciduliprofundum merupakan anaerobic termofil, kemoorganotrof yang menggunakan S⁰ atau Fe³⁺ sebagai akseptor elektron.

II. Crenarchaeota

Hidup di daerah ekstrem panas dan ekstrem dingin. Crenarchaeota hipertermofilik merupakan anaerob obligat. Energi disimpan selama proses pernapasan melalui mekanisme seperti pada bakteri yaitu transfer elektron dalam membrane sitoplasma yang menginduksi pembentukan proton motive force yang menghasilkan ATP.

a.                   Crenarchaeota dari lingkungan terrestrial vulkanik

Sulfolobus merupakan kemolitotrof aerob yang mengoksidasi H₂S atau S⁰ menjadi H₂SO₄ ,memfiksasi CO₂ sebagai sumber karbon, dan terkadang dapat mengoksidasi fe²⁺ menjadi Fe^3+. Acidianus mampu menggunakan S⁰ secara anaerob dan anaerob. Thermoproteus dan Thermofilum hidup dilingkungan netral atau berasam, bersifat anaerob yang menggunakan S⁰ pada respirasi anaerob. Pyrobaculum memiliki respirasi secara aerob, juga dapat secara anaerob menggunakan NO^3-, Fe³⁺, atau S⁰ sebagai akseptor elektron dan H₂ sebagai donor elektron.

b.                  Crenarchaeota dari lingkungan submarine vulkanik

Pyrodictium dan Pyrolobus tumbuh optimum pada temperatur diatas 100C. Pyrodictium bersifat anaerob, kemolitotrof yang menggunakan H₂ dengan S⁰ sebagai akseptor elektron. Pyrolobus atau Strain 121 bersifat anaerob, kemolitotrof dan autotrof yang menggunakan Fe³⁺ sebagai akseptor elektron dan H₂ sebagai donor elektron. Desulfurococcus adalah organisme pereduksi S⁰ secara anaerob dan kurang termofilik dibandingkan Pyrodictium. Ignicoccus adalah novel hyperthermophile karena mengandung membrane luar yang mirip dengan bakteri Gram negative. Staphylothermus bersifat kemoorganotrof, mendapatkan energi dari fermentasi peptide dan menghasilkan asam lemak asetat dan isovalerat.

c.                   Crenarchaeota dari habitat non-termal dan nitrifikasi pada Archaea

Crenarchaeota nontermofilik diidentifikasi dari sampel gen rRNA spesies pada lingkungan marine dan terrestrial yang memiliki temperatur tinggi(panas) hingga rendah (dingin). Marine Crenarchaeota mencakup 40% dari seluruh prokariot yang hidup di laut dalam, dan memiliki peranan penting dalam siklus karbon secara global. Fisiologi jenis ini masih dalam penelitian.

III. Evolusi dan Kehidupan pada temperatur tinggi

Black smokers mengeluarkan cairan hydthermal vent pada temperatur 250-350°C atau lebih,  membentuk metallic mound atau chimneys. Para pakar memprediksi bahwa batas atas temperatur  untuk prokariot adalah 140° C bahkan 150°C, dan temperatur maksimum yang masih memungkinkan survival tanpa adanya pertumbuhan. Banyak enzim dari spesies hipertermofil yang mengandung sifat struktur utama yang sama, baik pada struktur primer maupun sekunder.untuk menjaga kestabilan DNA pada temperatur tinggi, diperlukan beberapa mekanisme antara lain dengan meningkatkan level larutan sel, DNA-binding protein yang mengikat  DNA menjadi struktur seperti nukleosom dan mempertahankan DNA dalam bentuk dsDNA, dan stabilitas rRNA. Metabolisme kemolitotrof berdasarkan pada H₂ sebagai donor elektron ditemukan pada sebagian besar prokariot yang toleran terhadap panas tinggi.

Sumber:

Madigan, MT et al. 2009. Brock Biology of Microorganisms 13^th edition. San Fransisco: Pearson Benjamin Cummings . halaman 584-610.

Bersahabat Dengan Likopen, Bermusuhan Dengan Penyakit

Tomat, siapa yang tidak mengenal buah dan sayur yang satu ini? Buah yang dijuluki si apel cinta Karena dapat membangkitkan gairah cinta ini memiliki rasa yang enak dan segar serta  dapat diperoleh dengan sangat mudah dengan harga yang murah. Buah ini juga dapat diolah menjadi bermacam-macam produk, seperti jus, saus, bahkan untuk produk kecantikan seperti masker wajah. Dengan begitu banyaknya manfaat yang dapat diperoleh dari tomat, tentunya ada sesuatu yang terdapat dalam buah ini  yang begitu luar biasa, yaitu likopen.

Likopen banyak terkandung dalam  berbagai buah-buahan dan sayur mayur, salah satunya pada tomat. Tomat  merupakan salah satu buah yang dapat dijadikan sebagai sayur dan penyedap rasa dalam masakan (rempah-rempah). Tomat ini dapat dengan mudah didapatkan dengan harga yang terjangkau oleh sebagian besar masyarakat. Bahkan untuk menanamnya disekitar rumah pun dapat dilakukan dengan mudah.

Tomat yang memiliki nama latin Solanum lycopersicum ini mengandung berbagai senyawa antara lain solanin (0,007%), saponiin, asam folat, asam malat, asam sitrat, bioflavonoid (termasuk likopen, alfa dan beta karoten), protein, lemak, vitamin, mineral, dan histamin (Canene-Adam,dkk., 2005).

Kandungan asam p-kumarat dan asam klorogenat didalam tomat secara langsung mampu melemahkan zat nitrosamine,yaitu salah satu zat penyebab kanker yang mungkin terdapat dalam makanan. Kandungan lainnya yaitu asam malat dan asam sitrat yang dapat menjaga kebersihan saluran empedu sehingga dapat menghindari terbentuknya batu empedu. Selain itu asam malat dan asam nitrat ini juga dapat membersihkan penyempitan pembulluh darah ke penis yang disebabkan oleh penumopukkan lemak dan gula.

Untuk menjaga kecantikan, khususnya untuk perawatan wajah, tomat mengandung zat tomatin yang bersifat antiinflamasi (antiradang) sehingga dapat menyembuhkan radang pada jerawat. Zat tomatin juga bisa menyembuhkan luka, borok, wasir, usu buntu, hingg aradang saluran pemcernaan (bronchitis).

Likopen merupakan salah satu kandungan paling banyak dalam tomat, dalam 100 gram tomat rata-rata mengandung likopen sebanyak 3-5 mg (Giovannucci, 1999). Likopen mampu menghambat pertumbuhan kanker endometrial, kanker payudara, dan kanker paru-paru pada kultur sel dengan aktivitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan alfa dan beta karoten. (Levy et al, 1995) Likopen mampu menginaktifkan hydrogen peroksida dan nitrogen peroksida (Bohm,dkk., 1995). Dengan adanya proses penghambatan radikal bebas tersebut dapat dimungkinkan untuk menurunnya resiko kanker. Likopen yang banyak terkandung pada tomat ini berfungis sebagai antioksidan yang dapat mencegah kanker prostat pada pria tua dan mencegah kanker payudara pada wanita serta mampu mencegah osteoporosis. Likopen sebagai antioksidan ini dua kali lebih efektif dibandingkan betakaroten dalam melindungi sel darah putih dari kerusakan membrane sel oleh radikal bebas. Likopen yang diserap oleh tubuh akan disimpan didalam hati, paru-paru, kelenjar prostat, kolon, dan kulit (sinartani.com). menurut suatu penelitian yang dilakukan di Harvard University terhadap 48000 pria diperoleh hasil bahwa mereka yang memkaan produk olahan tomat sebanyak 10 kali seminggu memiliki resiko terkena kanker prostat lebih rendah 35 % daripada pria yang memakan tomat kurang dari 1,5 kali seminggu. Likopen dalam tomat ini juga mampu menurukan resiko terjadinya bercak-bercak kulit Karena penuaan (macular degeneration). Likopen yang merupakan antioksidan berdaya kerja tinggi sangat efektif melawan radikal bebas sehingga kesehatan fisik tetap terjaga dan juga menjaga agar awet muda.

Pada awal November tahun 1934, Dr. Bennet menyatakan buah tomat ini dapat mengobati diare, serangan empedu, gangguan pencernaan, dapat mencegah kolera, serta memulihkan fungsi liver. Pernyataan ini diperkuat oleh dr.Yumi Tohuoka pada tahun 1953 dalam laporan The Tohouka Journal of Experimental Medicine bahwa secara klinis tomat sangat efektif dalam menyeimbangkna gangguan liver.

Cara mengolah tomat yang benar dan sehat agar diperoleh kandungan manfaat dalam tomat secara maksimal yaitu sebagai berikut. Tomat dapat di konsumsi langsung baik melalui mekanisme mekanik (pengunyahan) maupun langsung minum setelah dibuat menjadi jus. Juga dapat dinikmati dalam bentuk produk olahan tomat seperti sup dan saus. Jika tomat dikonsumsi langsung secara mekanik (pengunyahan) maupun dalam bentuk jus, kita dapat memeroleh manfaat tinggi dari tomat antara lain beta-karoten, vitamin C, dan mineral kalium. Setelah tomat diolah (dimasak), Likopen akan lebih mudah keluar dari sel-sel buah dan lebih mudah larut sehingga proses pemasakan ini dianjurkan jika kita menginginkan likopen dalam kadar yang lebih tinggi. Selain itu, cara praktis lainnya untuk menikmati buah tomat ini yaitu dengan memotong-motong tomat segar berwarna merah yang belum  terlalu matang, lalu ditaburi gula atau madu secukupnya sesuai selera. Siram dengan air mendidih, tutup, dan biarkan dingin. Hal ini bisa dilakukan agar tidak bosan dalam mengonsumsi buah yang sangat bermanfaat ini.

Likopen ini merupakan pigmen alami (senyawa karotenoid) yang berbentuk isomer asiklik dari beta karoten dan tidak memiliki aktivitas sebagai vitamin A. (Agarwal dan rao, 1999). Likopen mempunyai rumus molekul C40H56 dengan berat molekul 536,85 da dan titik leleh 172-175 derajat Celsius. Struktur kimia likopen merupakan rantai tak jenuh dengan rantai lurus hidrokarbon terdiri dari tiga belas ikatan rangkap, duabelas diantaranya ikatan rangkap terkonjugasi, sementara dua ikatan rangkap sisanya tidak terkonjugasi (Agarwal dan rao, 2000).  Bentuk Kristal likopen ini seperti jarum panjang, dan akan berwarna kecoklatan jika dalam wujud tepung. Likopen ini bersifat hidrofobik kuat dan lebih mudah larut dalam kloform, benzene, heksana, danpelarut organic lainnya. Degradasi likopen dapat melalui proses isomerasasi dan oksidasi karena cahaya, oksigen, suhu tinggi, teknik pengeringan, proses pengelupasan, penyimpanan, dan asam. Studi lainmenyebutkan bahwa bioavaibilitas likopen dipengaruhi dosis konsumsi dan adanya karotenoid lain seperti berta laroten. (Johnson dkk., 1997).

Gambar 1. Struktur Likopen

Likopen sebagai antioksidan- blocking agent dapat mengeliminasi zat karsinogenik dari luar (virus, polusi, radiasi, xenobiotik) dengan mekanisme antioksidan. Aktivitas antioksidan berperan penting dalam meredam radikal bebas. Senyawa radikal bebas merupakan senyawa elektrofilik reaktif yang dapat bereaksi membentuk ikatan kovalen dengan makromolekul sel termasuk protein-protein dan asam nukleat (Mortensen dkk,1997). Likopen yang bersifat lipofil ini umumnya terdapat didalam membrane sel dan komponen lainnya. Dalam lingkungan yang lipofil, likopen memiliki kemampuan maksimum sebagai anti spesies oksigen reaktif atau radikal bebas. Likopen mampu membersihkan radikal  nitrogen diksida (NO2), thiyl (RS*), dan sulfonil (RSO2*). Likopen dapat mencegah kerusakan membrane dan kematian sel limposit oleh serangan NO2* dua kali lebih efissien disbanding betekaroten (Bohm dkk.,dan Tinkler dkk,. 1995). Likopen sebagai antioksidan nonenzimatis, secara signifikan dapat menurunkan enzim fase I seperti cytochrome p450-dependent enzymes dan meningkatkan enzim detoksifikasi fase II seperti hepatic quinine reductase (Breinholt dkk,.2000).

Likopen sebagai antioksidan – suppressing agent dilakukan dengan menggunakan mekanisme non-oksidatif, yaitu dengan pengaturan fungsi gen, perbaikan gap-junction communication, modulasi hormone tumbuh IGF-I dan respon imun atau pengaturan metabolism. Tingginya konsentrasi likopen dalam tomat mampu menghambat oksidasi pada tahap progresi dalam karsinogenik (Sies dan Stahl, 1995). Tahap progresi ini merupakan perbuahan genetiklebih lanjut menuntun pada terbentuknya kolonisel yang lebih besar. Timbulnya keistimewaan-keistimewaan lain seperti peningkatan mobilitas dan angiogenesis juga muncul pada fase ini.

Likopen mampu menjadi blocking agent maupun suppressing agent yang dapat mencegah inisiasi kanker. Bahkan dapat mencegah keganasan sel malignan bagi penderita kanker.

Dengan adanya sejuta manfaat yang dapat kita peroleh melalui konsumsi tomat, hendaknya kebiasaan mengonsumsi buah merah yang satu ini mulai dilakukan. Harganya yang dapat dijangkau oleh hampir seluruh lapisan masyarakat memungkinkan kita semua untuk dpaat mengambil manfaat dari kandungan yang dimilikinya untuk menjaga kesehatan tubuh kita. Selain itu cara untuk mengonsumsinya pun dapat dilakukan secara beragam sehingga tak ada alasan bagi kita untuk tidak dapat mengonsumsi buah tomat ini. Kandungan senyawa aktif berupa likopen yang manfaatnya sangat luar biasa ini harus kita manfaat sebaik-baik dan semaksimal mungkin. Mekanisme aksi senyawa likopen  sebagai agen kemopreventif melalui penghambatan cell cycle pada fase G1. Ayo Bersahabat dengan Likopen agar tubuh pun terhindar dari penyakit! J

  

 Daftar  Pustaka

Anonym 1. ------. Likopen dalam Tomat Mencegah Kanker Prostat dan Kanker Payudara. http://www.sinartani.com/penyuluhan/mimbar-penyuluhan/1459.html diakses 25-11-2011  pukul 20.30 wib

Agarwal S, rao AV. 2000. Role of Antioxidant Lycopene in Cancer and Heart Disease. Journal of The American College of Nutrition, Vol. 19, No. 5, hal 563-569.

Bohm F, Tinkler JH, Truscott TG. 1995. Carotenoids Protects Againts Cell Membrane Damage by The Nitrogen Dioxide Radical. Nature Med 1: 98-99.

Breinholt, V., S.T. Lauridsen, B. Daneshvar, & J. Jakobsen. 2000. Dose-response Effects of Lycopene on Slected Drug-Metabolizing and Antioxidant Enzyme in The Rat. Cancer Lett. 154:201-210.

Canine-Adams K, Clinton, S.K., King, J.L., Lindshield, B.L., Wharton C., Jeffery, E. & Erdman, J.W. JR.2004. The Growht oh The Dunning R-3327-H Transplantable Prostate Adenocarcinoma in Rats Fed Diets Containing Tomato, Broccoli, Lycopene, or Receiving Finasteride Teratment. FASEB J. 18:A886 (591.4)

Giovannucci, E. 1999. Tomatoes, Tomato-based Products, Lycopene, and Cancer: Review of The Epidemiologic Literature. J. Natl. Cancer Inst. 91:317-331.

Levy J, Bosin E, feldmen B, Giat Y, Miinster A, Danilenko M, Sharoni Y. 1995. Lycopene is A More  Potent Inhibitor of Human Cancer Cell Proliferation Than Either A-Carotene or Beta-Carotene. Nutrition Cancer 24:257-266.

Mia. 2005. Sehat dan NIkmat dengan Tomat. http://mediasehat.com/tanaman03.php  . Di akses 26-11-2011    pukul 15.25 wib .

Mortensen A, Skibsted LH: Relative Stability of Carotenoid Radical Cations and Homologue Tocopheroxyl Radicals. A Real Time Kinetic Study of Antioxidant Hierarchy. FEBS  Lett 417: 261-266, 1997.

Rekombinan DNA, Aktivitas Enzim, dan Sterilisasi

1.    Rekombinasi DNA dilakukan dengan memasukkan DNA gen pengkode enzim selulase pada bakteri A ke dalam gen bakteri B. Hal ini dilakukan karena bakteri B dapat tumbuh baik dalam medium dengan komposisi sederhana sehingga tidak membutuhkan dana besar untuk menyediakan medium pertumbuhan bakteri. Dan pada akhirnya didapatkan bakteri yang memiliki gen pengkode enzim selulase yang dapat tumbuh dengan baik pada medium dengan komposisi sederhana (ekonomis).

Metode rekombinasi DNA yang dilakukan harus melalui tahap-tahap antara lain isolasi DNA genomic / kromosom yang akan diklon, pemotongan molekul DNA menjadi sejumlah fragmen dengan berbagai ukuran, isolasi DNA vector, penyisipan fragmen DNA ke dalam vector untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan, transformasi sel inang menggunakan molekul DNA rekombinan, reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang, dan analisis DNA rekombinan.

a.    Isolasi DNA sisipan

Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh, maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relative lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium buffer nonosmotik sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Pembuangan remukan sel  dilakukan dengan cara sentrifugasi, lalu protein dan RNA masing-masing dihilangkan menggunakan kloroform dan RNAse. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan, misalnya dengan penambahan ammonium asetat dan alcohol. DNA hasil isolasi dikatakan baik apabila mempunyai tingkat kemurnian yang tinggi dan tidak mengalami fragmentasi.

b.    Pemotongan molekul DNA menjadi sejumlah fragmen dengan berbagai ukuran

Pemotongan molekul DNA dilakukan menggunakan enzim restriksi. Enzim restriksi yang digunakan pada DNA rekombinan adalah enzim restriksi tipe II. Enzim ini memotong ikatan fosfodiesterase dan mengenali urutan palindrome 5’ GAATTC 3’ --- 3’CTTAAG 5’.

 DNA (enzim restriksi)

          5’-NNNGAATTCNNN-3’

          3’-NNNCTTAAGNNN-5’

 

                                  EcoRI

5’-NNNG_{OH                      P}AATTCNNN -3’

3’NNNCTTAA_{P              OH}GNNN -5’

-          Sisi pengenalan enzim restriksi

-          Urutan nukleotida rantai atas = urutan nukleotida rantai bawah

Selain itu, enzim restriksi tipe II juga mempunyai sifat-sifat umum yang penting antara lain:

-          Mengenali urutan tertentu sepanjang empat hingga tujuh pasang basa di dalam molekul DNA

-          Memotong kedua untai molekul DNA di tempat tertentu pada atau di dekat tempat pengenalannya

-          Menghasilkan fragmen-fragmen DNA denagn berbagai ukuran dan urutan basa

c.    Isolasi DNA vector

Plasmid digunakan sebagai vector untuk mengklonkan fragmen DNA yang nantinya akan mengubah sifat bakteri. Plasmid juga digunakanuntuk memperbanyak gen (copy gene) yang telah disisipkan dengan bantuan sel bakteri.

d.    Penyisipan fragmen DNA ke dalam vector untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan

Penyisipan dilakukanmenggunakan DNA (ligase).

DNA (ligase)

5’-NNNG_{OH                      P}AATTCNNN-3’

3’-NNNCTTAA_{P             OH}GNNN-5’

 

                           Ligase

5’-NNNGAATTCNNN-3’

3’-NNNCTTAAGNNN-5’

e.    Transformasi sel inang menggunakan molekul DNA rekombinan dan perbanyakan DNA

Setelah ligasi dilakukan, berikutnya dilakukan analisis terhadap hasil pemotongan DNA genomic dan DNA vector serta analisis hasil ligasi molekul-molekul DNA tersebut menggunakan teknik elektroforesis. Jika hasil elektroforesis menunjukkan bahwa fragmen-fragmen DNA genomic telah terligasi dengan baik pada DNA vector sehingga terbentuk molekul DNA rekombinan, campuran reaksi ligasi dimasukkan ke dalam sel inang agar dapat diperbanyak dengan cepat. Dengan sendirinya, di dalam campuran reaksi tersebut terdapat molekul DNA rekombinan dan sejumlah fragmen DNA genomic dan DNA plasmid yang tidak terligasi satu sama lain. Pada tahap transformasi ini sel inang diharapkan akan mengalami perubahan sifat tertentu setelah dimasuki molekul DNA rekombinan. Dalam kasus ini yaitu bakteri B akan mempunyai gen yang dapat mengkode enzim selulase dan dapat hidup di dalam medium dengan komposisi sederhana.

f.     Seleksi : sel yang mengandung plasmid atau vector rekombinan

Oleh Karena DNA yang dimasukkan ke dalam sel inang bukan hanya DNA rekombinan, maka harus dilakukan seleksi untuk memilih sel inang transforman yang membawa DNA rekombinan. Lalu, diantara sel-sel transforman yang membawa DNA rekombinan masih harus dilakukan seleksi untuk mendapatkan sel yang DNA rekombinannya membawa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan. Setelah transforman dilakukan, ada tiga kemungkinan yang dapat etrjadi, antara lain: (1) sel inang tidak dimasuki DNA apapun atau berarti transformasi gagal, (2) sel inang dimasuki vector religasi atau berarti ligasi gagal, dan (3) sel inang dimasuki vector rekombinan dengan atau tanpa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan. 

g.    Analisis keberadaan DNA sisipan dan DNA rekombinan

Deteksi keberadaan DNA sisipan dilakukan dengan berbagai cara antara lain:

-          Analisis migrasi

-          Analisis restriksi                   elektroforesis gel

-          PCR

-          Penentuan urutan DNA sisipan (sekuensing)

-          Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe), yang pembuatannya dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase chain reaction (PCR).  Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan melalui cara hibridisasi koloni. Koloni-koloni sel rekombinan ditransfer ke membrane nilon, di lisis agar isi selnya keluar, dibersihkan protein dan remukan sel lainnya hingga tinggal tersisa DNAnya saja. Selanjutnya dilakukan fiksasi DNA dan perendaman di dalam larutan pelacak. Posisi-posisi DNA yang terhibridisasi oleh fragmen pelacak dikocokkan dengan posisi koloni pada kultur awal (master plate). Dengan demikian , kita bisa menentukan koloni-koloni sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan.

2.    A. Bakteri yang ditumbuhkan dalam medium yang kaya phenilalanin akan memiliki metabolisme yang berbeda. Bakteri ini tidak akan memproduksi enzim yang berperan dalam biosintesis phenilalanin karena jumlah phenilalanin yang berlimpah dalam medium akan memberikan feedback negative terhadap produksi enzim tersebut.

Sedangkan bakteri B yang ditumbuhkan dalam medium yang miskin phenilalanin akan tetap memiliki kemampuan untuk memproduksi enzim yang dapat melakukan biosintesis phenilalanin.

Gen yang berperan dalam biosintesis phenilalanin pada bakteri B diatur oleh kromosom bakteri pada operon phenilalanin. Sebuah operon adalah suatu kelompok gen yang dikendalikan oleh beberapa elemen yang sama dan diatur proses transkripsi dan translasinya. Operon ini memiliki Promotor, Operator, dan Attenuator.

B. sistem ekspresi gen pada suatu organisme menggunakan suatu regulasi tertentu agar penggunaan energy digunakan efektif dan efisien. Salah satunya dengan menggunakan lac operon. Operon adalah sekumpulan gen yang terletak diantara promoter dan terminator. Istilah ini dikemukakan oleh Monod dan Jacob untuk menjelaskan penemuannya yaitu sistem operon laktosa pada E.coli,  dalam kasus ini yaitu pada bakteri B. Bakteri B dapat memanfaatkan keberadaan glukosa dan laktosa pada mediumnya. Apabila didalam medium (lingkungan) terdapat glukosa dan laktosa maka bakteri B akan menggunakna glukosa terlebih dahulu bagai sumber karbon. Hal ini dikarenakan laktosa adalah suatu disakarida sehingga untuk mengubahnya menjadi glukosa dan galaktosa dibutuhkan suatu enzim beta-galaktosidase. Apabila di medium hanya terdapat laktosa maka enzim ini akan dilepaskan oleh bakteri B, sedangkan apabila terdapat glukosa maka glukosa ini akan digunakan terlebih dahulu selanjutnya adalah laktosa. Pada operon laktosa terdapat tiga gen structural yaitu gen lac Z, lac Y, dan lac A. Masing-masing gen ini mengatur ekspresi enzim beta-galaktosidase , permease, dan asetilase. Ekspresi ketiga gen ini diatur oleh suatu gen regulator yang berinteraksi dengan promoter. Gen protein regulator ini adalah gen yang proteinnya digunakan untuk mengatur ekspresi gen lain. Jadi, gen-gen dalam suatu operon berkaitan satu sama lain dalam mengatur metabolisme.        

C. pada umumnya enzim tersusun dari protein. Protein penyusun enzim dapat berupa protein sederhana atau protein yang terikat pada gugusan non-protein. Banyak enzim yang hanya terdiri dari protein saja misalnya tripsin. Adanya beragam cara pembentukan enzim mengakibatkan terjadinya penggolongan enzim berdasarkan cara terbentuknya yaitu enzim konstitutif dan enzim adaptif.

     -    Enzim konstitutif

            Didalam sel terdaoat enzim yang merupakan bagian dari susunan sel normal sehingga enzim tersebut selalu ada umumnya dalam jumlah tetap pada sel hidup. walaupun demikian, ada enzim yang jumlahnya dipengaruhi kadar substratnya, misalnya enzim amylase. Sedangkan enzim-enzim yang berperan dalam proses respirasi jumlahnya tidak dipengaruhi olehkadar substratnya.

-          Enzim Adaptif

Perubahan lingkungan mikroba dapat menginduksi terbentuknya enzim tertentu. Induksi menyebabkan kecepatan sintesis suatu enzim dapat dirangsang sampai beberapa kali. Enzim adaptif adalah enzim yang pembentukannya dirangsang oleh adanya substrat. Sebagai contoh adalah enzim beta galaktosidase yang dihasilkan oleh bakteri E.coli yang ditumbuhkan didalam medium yang mengandung laktosa. Mula-mula E.coli tidak dapat menggunakna laktosa sehingga awalnya tidak Nampak adanya pertumbuhan (fase lag/ fase adaptasi panjang) setelah beberapa waktu baru menampakkan pertumbuhan. Selama fase lag tersebut E.coli membentuk enzim beta galaktosidase yang digunakan untuk merombak laktosa.

           

3.    A.        - sterilisasi secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil (0,22 mikron atau 0,45 mikron) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas. Misalnya larutan enzim dan antibiotic seperti chloramphenicol.

- sterilisasi secara fisik yaitu dengan pemanasan (pemijaran dengan api langsung) pada peralatan laboratorium berbahan dasar stainless steel seperti jarum inokulum, pinset, dll.

- stelirilasasi secara fisik yaitu panas kering, sterilisasi dengan oven kira-kira 60-180 derajat Celsius pada peralatan laboratorium berbahan dasar gelas seperti Erlenmeyer, tabung reaksi, dll.

- sterilisasi secara panas lembab menggunakan autoklaf pada medium pertumbuhan bakteri. Autoklaf adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang digunakan dalam mikrobiologi menggunakan uap air panas bertekanan. Tekanan yang digunakan pada umumnya 15 Psi atau sekitar 2 atm dan dengan suhu 121 derajat Celsius (250 derajat Fahrenheit). Jadi tekanan yang bekerja ke seluruh permukaan benda adalah 15 pon/ inchi² (15 Psi = 15 pounds per square inch). Lama sterilisasi yang dilakukan biasanya 15 menit untuk 121 derajat Celsius.

- sterilisasi susu secara pasteurisasi. Melalui pasteurisasi, susu dipanaskan dengan tujuan membunuh mikroba yang merugikan seperti virus, protozoa, dan bakteri. Mikroba menguntungkan masih dibiarkan tetap hidup. Berdasarkan ketinggian suhu yang dilakukan,pasteurisasi dibagi menjadi tiga jenis, antara lain pasteurisasi model HTST (High Temperature Short Time) yang dilakukan pada suhu 75  derajat Celsius selama 15 detik menggunakan Heat Plate Exchanger, pasteurisasi model UHT (Ultra High Termperature) yang dilakukan pada suhu 130 derajat Celsius selama 0,5 detik saja dan mampu membunuh seluruh mikroba dalam susu sehingga menghasilkan susu steril, dan Pasteurisasi model LTLT (Low temperature Long Time) yang dilakukan pada suhu rendah sekitar 60 derajat Celsius selama 30 menit.

- sterilisasi dengan radiasi sinar UV yang dapat merusak sel mikroba.

- Sterilisasi dengan menambahkan antibotik pada medium. Antibiotic yang digunakan harus selektif untuk membunuh jenis mikroba tertentu karena antibiotic ini dapat merusak sel.

         

   B.

Sistem sterilisasi	Kelebihan	Kelemahan
Filtrasi	-Sterilisasi media yang tidak tahan panas -Penggunaan penyaring tertentu mempunyai kecenderungan mengabsorbsi beberapa senyawa aktif tertentu selama proses penyaringan. -peralatan yang digunakan murah -waktu yang dibutuhkan sedikit karena ada bantuan panas dan uap	-Pada umumnya tidak dapat menahan mikroorganisme tanpa dinding sel (mikroplasma) -kemungkina kerusakan bentuk penyaring sehingga kesterilan hasil yang diperoleh tidak pasti. - tidak dapat menyaring virus - hanya sekali pakai
Pemanasan (pemijaran dengan api langsung)	Dapat dilakukan dimana saja dan kapanpun. Peralatan murah	Hanya dapat digunakan untuk bahan yang tidak terbakar seperti stainless steel.
Panas kering	Tidak ada uap air yang membasahi peralatan yang disterilkan. Hemat waktu dan alat-alat yang dibutuhkan. -peralatan yang di gunakan murah	-Memerlukan temperatur yang tinggi dan waktu yang lama - belum tentu dapat membunuh semua bakteri -adanya pengaruh radiasi pada produk-produk dan wadah -dengan panjang gelombang yang pendek mempunyai daya antimicrobial yang kuat - tidak dapat digunakan untuk alat-alat gelas yang membutuhkan keakuratan (contoh: alat ukur) dan penutup karet atau plastik
Autoklaf	Waktu cepat	Terdapatnya tetesan uap air yang mengenai alat dan bahan yang disterilisasi
Pasteurisasi	Dapat membunuh seluruhmikroba pathogen dan pembusuk tanpa mengurangi nilai gizi susu	Daya simpan hanya sekitar 14 hari.
Radiasi sinar UV	Dapat menghilangkan mikroba tertentu sesuai yang diinginkan.	Bisa menyebabkan mutasi jika kadar radiasinya tidak tepat.
Penambahan Antibiotik pada medium	Dapat membunuh mikroorganisme tertentu karena digunakan secara selektif	Adanya mikroorganisme yang yang tidak mati Karena mengalami resistensi terhadap antibiotic yang digunakan.

           

C.

Sistem sterilisasi	Alat dan atau bahan
Filtrasi	Vaksin, enzim, vitamin, antibiotic (Chloramphenicol)
Pemanasan (pemijaran dengan  api langsung)	Peralatan laboratorium berbahan dasar stainless steel, alat bedah
Panas kering	Peralatan laboratorium berbahan dasar kaca.
Autoklaf (panas basah)	Medium pertumbuhan bakteri, aquades
Pasteurisasi	Susu
Radiasi sinar UV	Jas laboratorium,  permukaan interior laminar air flow ( BSC= biological safety cabinet)
Penambahan antibiotik ke  dalam medium	vaksin

           

 D. Pengujian keberhasilan sistem sterilisasi yang digunakan dapat dilakukan melalui beberapa teknik antara lain:

                -  uji reduktase biru metilen (Methylen Blue Reduction Test) .

        Test ini digunakan untuk menguji kualitas susu. Di dalam susu segar terdapat enzim reduktase yang dibentuk oleh mikrpba didalamnya yang dapat mereduksi zat warna indicator menjadi larutan tidak berwarna. Cara pengujiannya: susu dimasukkan ke dalam tabung yang sudah berisi indicator methylen blue, lalu dicampur dengan menutup tabung dan membolak-balikkan tabung sampai warna biru tersebar merata. Tabung tersebut dimasukkan kedalam penangas air (37 derajat Celsius) selama 5 menit untuk menghangatkan, setelah itu dimasukkan ke dalam incubator. Amati perubahan warna menjadi putih setelah beberapa waktu tertentu.

Waktu reduksi	Kualitas susu
0-20 menit	Jelek, diperkirakan mengandung bakteri lebih dari 20 juta/ml
20 menit – 2 jam	Kelas 3, diperkirakan mengandung bakteri 4-20 juta/ml
2 – 4,5 jam	Kelas 2, diperkirakan mengandung bakteri 0,5-4 juta/ml
4,5 – 5,5 jam	Kelas 1, diperkirakan mengandung bakteri kurang dari 0,5 juta/ml
Lebih dari 6 jam	Susu mengalami perlakuan (didihkan, ditambah atau mengandung antibiotika, ditambah disinfektan)

-          Uji sterilitas secara Direct inoculation of culture medium (inokulasi langsung) dengan media tioglikolat cair yang mengandung glukosa dan Na Tioglikolat untuk pembiakkan dalam kondisi aerob pada suhu inkubasi 31 derajat celsius.

Uji sterilisasi terhadap sediaan kloramfenikol

1.    Diambil sediaan sebanyak 1 ml menggunakan spuit injeksi yang steril

2.    Diinokulasikan dalam tabung reaksi berisi media tioglikolat cair.

3.    Pengerjaan dilakukan secara aseptis.

4.    Mulut tabung reaksi disumbat dengan menggunakan kapas

5.    Diinkubasi pada suhu 31 derajat Celsius selama 7 hari

6.    Pertumbumbuhan diamati pada media secara visual sesering mungkin sekurangnya pada hari ke3 atau ke-5, pada hari ke-7 (hari terakhir dari masa uji)

7.    Diamati kekeruhanmedia. Jika keruh, kemungkina terdapatnya mikroba.

Uji sterilitas terhadap sediaan injeksi vitamin (vitamin C)

1.    Diambil sediaan sebanyak 1 ml menggunakna spuit injeksi yang steril

2.    Diinokulasikan dalam tabunh reaksi berisi media tioglikolat cair

3.    Pengerjaan dilakukan secara aseptis

4.    Mulut tabung reaksi disumbat denganmenggunakan kapas

5.    Diinkubasi pada suhu 31 derajat Celsius selama 7 hari

6.    Pertumbumbuhan diamati pada media secara visual sesering mungkin sekurangnya pada hari ke3 atau ke-5, pada hari ke-7 (hari terakhir dari masa uji)

7.    Diamati kekeruhanmedia. Jika keruh, kemungkinan terdapatnya mikroba.

-          Uji resazurin untuk menentukan kualitas susu

Dasar dari uji ini yaitu kemampuan bakteriuntuk mereduksi warna. Pengujian dilakukan dengan memasukkan 10 ml sampel susu segar ke dalam tabung reaksi kemudian ditambah dengan 1 ml larutan resazurin 0,01% dan dipanaskan dalam water bath selama 30 menit. Selanjutnya contoh susu tersebut dibandingkan dengan blanko dalam alat pembanding warna yang mempunyai skala 0-6. Diamati perubahan warna yang terjadi dan ditentukan kualitasnya, jika susu berwarna biru dapat dinyatakan susu tersebut memiliki kualitas bagus karena semakin sedikit bahkan tidak adanya bakteri yang mereduksi resazurin. Sebaliknya, semakin memudarnya warna susu (menuju pink), dapat dinyatakan susu  tersebut berkualitas buruk karena semakin banyak bakteri yang mereduksi resazurin.

Daftar Pustaka:

Campbell & Reece. 2010. Biologi Edisi ke 8. Jakarta: Erlangga.

Retnoningrum, Debbie S. 2010. Prinsip Teknologi DNA Rekombinan. Bandung: Sekolah Farmasi ITB

Todar, Kenneth. 2008. Regulasi dan Kontrol Metabolisme Pada Bakteri. www.textbookofbacteriology.net. di akses 30 desember 2011   11.00 wib

Wibowo, Marlia Singgih. 2011. Uji Sterilitas. Bandung: Sekolah Farmasi ITB

Yuwono, T. 2005. Biologi Molekular. Jakarta: Erlangga.