Rekombinan DNA, Aktivitas Enzim, dan Sterilisasi

1.    Rekombinasi DNA dilakukan dengan memasukkan DNA gen pengkode enzim selulase pada bakteri A ke dalam gen bakteri B. Hal ini dilakukan karena bakteri B dapat tumbuh baik dalam medium dengan komposisi sederhana sehingga tidak membutuhkan dana besar untuk menyediakan medium pertumbuhan bakteri. Dan pada akhirnya didapatkan bakteri yang memiliki gen pengkode enzim selulase yang dapat tumbuh dengan baik pada medium dengan komposisi sederhana (ekonomis).

Metode rekombinasi DNA yang dilakukan harus melalui tahap-tahap antara lain isolasi DNA genomic / kromosom yang akan diklon, pemotongan molekul DNA menjadi sejumlah fragmen dengan berbagai ukuran, isolasi DNA vector, penyisipan fragmen DNA ke dalam vector untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan, transformasi sel inang menggunakan molekul DNA rekombinan, reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang, dan analisis DNA rekombinan.

a.    Isolasi DNA sisipan

Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh, maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relative lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium buffer nonosmotik sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Pembuangan remukan sel  dilakukan dengan cara sentrifugasi, lalu protein dan RNA masing-masing dihilangkan menggunakan kloroform dan RNAse. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan, misalnya dengan penambahan ammonium asetat dan alcohol. DNA hasil isolasi dikatakan baik apabila mempunyai tingkat kemurnian yang tinggi dan tidak mengalami fragmentasi.

b.    Pemotongan molekul DNA menjadi sejumlah fragmen dengan berbagai ukuran

Pemotongan molekul DNA dilakukan menggunakan enzim restriksi. Enzim restriksi yang digunakan pada DNA rekombinan adalah enzim restriksi tipe II. Enzim ini memotong ikatan fosfodiesterase dan mengenali urutan palindrome 5’ GAATTC 3’ --- 3’CTTAAG 5’.

 DNA (enzim restriksi)

          5’-NNNGAATTCNNN-3’

          3’-NNNCTTAAGNNN-5’

 

                                  EcoRI

5’-NNNG_{OH                      P}AATTCNNN -3’

3’NNNCTTAA_{P              OH}GNNN -5’

-          Sisi pengenalan enzim restriksi

-          Urutan nukleotida rantai atas = urutan nukleotida rantai bawah

Selain itu, enzim restriksi tipe II juga mempunyai sifat-sifat umum yang penting antara lain:

-          Mengenali urutan tertentu sepanjang empat hingga tujuh pasang basa di dalam molekul DNA

-          Memotong kedua untai molekul DNA di tempat tertentu pada atau di dekat tempat pengenalannya

-          Menghasilkan fragmen-fragmen DNA denagn berbagai ukuran dan urutan basa

c.    Isolasi DNA vector

Plasmid digunakan sebagai vector untuk mengklonkan fragmen DNA yang nantinya akan mengubah sifat bakteri. Plasmid juga digunakanuntuk memperbanyak gen (copy gene) yang telah disisipkan dengan bantuan sel bakteri.

d.    Penyisipan fragmen DNA ke dalam vector untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan

Penyisipan dilakukanmenggunakan DNA (ligase).

DNA (ligase)

5’-NNNG_{OH                      P}AATTCNNN-3’

3’-NNNCTTAA_{P             OH}GNNN-5’

 

                           Ligase

5’-NNNGAATTCNNN-3’

3’-NNNCTTAAGNNN-5’

e.    Transformasi sel inang menggunakan molekul DNA rekombinan dan perbanyakan DNA

Setelah ligasi dilakukan, berikutnya dilakukan analisis terhadap hasil pemotongan DNA genomic dan DNA vector serta analisis hasil ligasi molekul-molekul DNA tersebut menggunakan teknik elektroforesis. Jika hasil elektroforesis menunjukkan bahwa fragmen-fragmen DNA genomic telah terligasi dengan baik pada DNA vector sehingga terbentuk molekul DNA rekombinan, campuran reaksi ligasi dimasukkan ke dalam sel inang agar dapat diperbanyak dengan cepat. Dengan sendirinya, di dalam campuran reaksi tersebut terdapat molekul DNA rekombinan dan sejumlah fragmen DNA genomic dan DNA plasmid yang tidak terligasi satu sama lain. Pada tahap transformasi ini sel inang diharapkan akan mengalami perubahan sifat tertentu setelah dimasuki molekul DNA rekombinan. Dalam kasus ini yaitu bakteri B akan mempunyai gen yang dapat mengkode enzim selulase dan dapat hidup di dalam medium dengan komposisi sederhana.

f.     Seleksi : sel yang mengandung plasmid atau vector rekombinan

Oleh Karena DNA yang dimasukkan ke dalam sel inang bukan hanya DNA rekombinan, maka harus dilakukan seleksi untuk memilih sel inang transforman yang membawa DNA rekombinan. Lalu, diantara sel-sel transforman yang membawa DNA rekombinan masih harus dilakukan seleksi untuk mendapatkan sel yang DNA rekombinannya membawa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan. Setelah transforman dilakukan, ada tiga kemungkinan yang dapat etrjadi, antara lain: (1) sel inang tidak dimasuki DNA apapun atau berarti transformasi gagal, (2) sel inang dimasuki vector religasi atau berarti ligasi gagal, dan (3) sel inang dimasuki vector rekombinan dengan atau tanpa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan. 

g.    Analisis keberadaan DNA sisipan dan DNA rekombinan

Deteksi keberadaan DNA sisipan dilakukan dengan berbagai cara antara lain:

-          Analisis migrasi

-          Analisis restriksi                   elektroforesis gel

-          PCR

-          Penentuan urutan DNA sisipan (sekuensing)

-          Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe), yang pembuatannya dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase chain reaction (PCR).  Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan melalui cara hibridisasi koloni. Koloni-koloni sel rekombinan ditransfer ke membrane nilon, di lisis agar isi selnya keluar, dibersihkan protein dan remukan sel lainnya hingga tinggal tersisa DNAnya saja. Selanjutnya dilakukan fiksasi DNA dan perendaman di dalam larutan pelacak. Posisi-posisi DNA yang terhibridisasi oleh fragmen pelacak dikocokkan dengan posisi koloni pada kultur awal (master plate). Dengan demikian , kita bisa menentukan koloni-koloni sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan.

2.    A. Bakteri yang ditumbuhkan dalam medium yang kaya phenilalanin akan memiliki metabolisme yang berbeda. Bakteri ini tidak akan memproduksi enzim yang berperan dalam biosintesis phenilalanin karena jumlah phenilalanin yang berlimpah dalam medium akan memberikan feedback negative terhadap produksi enzim tersebut.

Sedangkan bakteri B yang ditumbuhkan dalam medium yang miskin phenilalanin akan tetap memiliki kemampuan untuk memproduksi enzim yang dapat melakukan biosintesis phenilalanin.

Gen yang berperan dalam biosintesis phenilalanin pada bakteri B diatur oleh kromosom bakteri pada operon phenilalanin. Sebuah operon adalah suatu kelompok gen yang dikendalikan oleh beberapa elemen yang sama dan diatur proses transkripsi dan translasinya. Operon ini memiliki Promotor, Operator, dan Attenuator.

B. sistem ekspresi gen pada suatu organisme menggunakan suatu regulasi tertentu agar penggunaan energy digunakan efektif dan efisien. Salah satunya dengan menggunakan lac operon. Operon adalah sekumpulan gen yang terletak diantara promoter dan terminator. Istilah ini dikemukakan oleh Monod dan Jacob untuk menjelaskan penemuannya yaitu sistem operon laktosa pada E.coli,  dalam kasus ini yaitu pada bakteri B. Bakteri B dapat memanfaatkan keberadaan glukosa dan laktosa pada mediumnya. Apabila didalam medium (lingkungan) terdapat glukosa dan laktosa maka bakteri B akan menggunakna glukosa terlebih dahulu bagai sumber karbon. Hal ini dikarenakan laktosa adalah suatu disakarida sehingga untuk mengubahnya menjadi glukosa dan galaktosa dibutuhkan suatu enzim beta-galaktosidase. Apabila di medium hanya terdapat laktosa maka enzim ini akan dilepaskan oleh bakteri B, sedangkan apabila terdapat glukosa maka glukosa ini akan digunakan terlebih dahulu selanjutnya adalah laktosa. Pada operon laktosa terdapat tiga gen structural yaitu gen lac Z, lac Y, dan lac A. Masing-masing gen ini mengatur ekspresi enzim beta-galaktosidase , permease, dan asetilase. Ekspresi ketiga gen ini diatur oleh suatu gen regulator yang berinteraksi dengan promoter. Gen protein regulator ini adalah gen yang proteinnya digunakan untuk mengatur ekspresi gen lain. Jadi, gen-gen dalam suatu operon berkaitan satu sama lain dalam mengatur metabolisme.        

C. pada umumnya enzim tersusun dari protein. Protein penyusun enzim dapat berupa protein sederhana atau protein yang terikat pada gugusan non-protein. Banyak enzim yang hanya terdiri dari protein saja misalnya tripsin. Adanya beragam cara pembentukan enzim mengakibatkan terjadinya penggolongan enzim berdasarkan cara terbentuknya yaitu enzim konstitutif dan enzim adaptif.

     -    Enzim konstitutif

            Didalam sel terdaoat enzim yang merupakan bagian dari susunan sel normal sehingga enzim tersebut selalu ada umumnya dalam jumlah tetap pada sel hidup. walaupun demikian, ada enzim yang jumlahnya dipengaruhi kadar substratnya, misalnya enzim amylase. Sedangkan enzim-enzim yang berperan dalam proses respirasi jumlahnya tidak dipengaruhi olehkadar substratnya.

-          Enzim Adaptif

Perubahan lingkungan mikroba dapat menginduksi terbentuknya enzim tertentu. Induksi menyebabkan kecepatan sintesis suatu enzim dapat dirangsang sampai beberapa kali. Enzim adaptif adalah enzim yang pembentukannya dirangsang oleh adanya substrat. Sebagai contoh adalah enzim beta galaktosidase yang dihasilkan oleh bakteri E.coli yang ditumbuhkan didalam medium yang mengandung laktosa. Mula-mula E.coli tidak dapat menggunakna laktosa sehingga awalnya tidak Nampak adanya pertumbuhan (fase lag/ fase adaptasi panjang) setelah beberapa waktu baru menampakkan pertumbuhan. Selama fase lag tersebut E.coli membentuk enzim beta galaktosidase yang digunakan untuk merombak laktosa.

           

3.    A.        - sterilisasi secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil (0,22 mikron atau 0,45 mikron) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas. Misalnya larutan enzim dan antibiotic seperti chloramphenicol.

- sterilisasi secara fisik yaitu dengan pemanasan (pemijaran dengan api langsung) pada peralatan laboratorium berbahan dasar stainless steel seperti jarum inokulum, pinset, dll.

- stelirilasasi secara fisik yaitu panas kering, sterilisasi dengan oven kira-kira 60-180 derajat Celsius pada peralatan laboratorium berbahan dasar gelas seperti Erlenmeyer, tabung reaksi, dll.

- sterilisasi secara panas lembab menggunakan autoklaf pada medium pertumbuhan bakteri. Autoklaf adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang digunakan dalam mikrobiologi menggunakan uap air panas bertekanan. Tekanan yang digunakan pada umumnya 15 Psi atau sekitar 2 atm dan dengan suhu 121 derajat Celsius (250 derajat Fahrenheit). Jadi tekanan yang bekerja ke seluruh permukaan benda adalah 15 pon/ inchi² (15 Psi = 15 pounds per square inch). Lama sterilisasi yang dilakukan biasanya 15 menit untuk 121 derajat Celsius.

- sterilisasi susu secara pasteurisasi. Melalui pasteurisasi, susu dipanaskan dengan tujuan membunuh mikroba yang merugikan seperti virus, protozoa, dan bakteri. Mikroba menguntungkan masih dibiarkan tetap hidup. Berdasarkan ketinggian suhu yang dilakukan,pasteurisasi dibagi menjadi tiga jenis, antara lain pasteurisasi model HTST (High Temperature Short Time) yang dilakukan pada suhu 75  derajat Celsius selama 15 detik menggunakan Heat Plate Exchanger, pasteurisasi model UHT (Ultra High Termperature) yang dilakukan pada suhu 130 derajat Celsius selama 0,5 detik saja dan mampu membunuh seluruh mikroba dalam susu sehingga menghasilkan susu steril, dan Pasteurisasi model LTLT (Low temperature Long Time) yang dilakukan pada suhu rendah sekitar 60 derajat Celsius selama 30 menit.

- sterilisasi dengan radiasi sinar UV yang dapat merusak sel mikroba.

- Sterilisasi dengan menambahkan antibotik pada medium. Antibiotic yang digunakan harus selektif untuk membunuh jenis mikroba tertentu karena antibiotic ini dapat merusak sel.

         

   B.

Sistem sterilisasi	Kelebihan	Kelemahan
Filtrasi	-Sterilisasi media yang tidak tahan panas -Penggunaan penyaring tertentu mempunyai kecenderungan mengabsorbsi beberapa senyawa aktif tertentu selama proses penyaringan. -peralatan yang digunakan murah -waktu yang dibutuhkan sedikit karena ada bantuan panas dan uap	-Pada umumnya tidak dapat menahan mikroorganisme tanpa dinding sel (mikroplasma) -kemungkina kerusakan bentuk penyaring sehingga kesterilan hasil yang diperoleh tidak pasti. - tidak dapat menyaring virus - hanya sekali pakai
Pemanasan (pemijaran dengan api langsung)	Dapat dilakukan dimana saja dan kapanpun. Peralatan murah	Hanya dapat digunakan untuk bahan yang tidak terbakar seperti stainless steel.
Panas kering	Tidak ada uap air yang membasahi peralatan yang disterilkan. Hemat waktu dan alat-alat yang dibutuhkan. -peralatan yang di gunakan murah	-Memerlukan temperatur yang tinggi dan waktu yang lama - belum tentu dapat membunuh semua bakteri -adanya pengaruh radiasi pada produk-produk dan wadah -dengan panjang gelombang yang pendek mempunyai daya antimicrobial yang kuat - tidak dapat digunakan untuk alat-alat gelas yang membutuhkan keakuratan (contoh: alat ukur) dan penutup karet atau plastik
Autoklaf	Waktu cepat	Terdapatnya tetesan uap air yang mengenai alat dan bahan yang disterilisasi
Pasteurisasi	Dapat membunuh seluruhmikroba pathogen dan pembusuk tanpa mengurangi nilai gizi susu	Daya simpan hanya sekitar 14 hari.
Radiasi sinar UV	Dapat menghilangkan mikroba tertentu sesuai yang diinginkan.	Bisa menyebabkan mutasi jika kadar radiasinya tidak tepat.
Penambahan Antibiotik pada medium	Dapat membunuh mikroorganisme tertentu karena digunakan secara selektif	Adanya mikroorganisme yang yang tidak mati Karena mengalami resistensi terhadap antibiotic yang digunakan.

           

C.

Sistem sterilisasi	Alat dan atau bahan
Filtrasi	Vaksin, enzim, vitamin, antibiotic (Chloramphenicol)
Pemanasan (pemijaran dengan  api langsung)	Peralatan laboratorium berbahan dasar stainless steel, alat bedah
Panas kering	Peralatan laboratorium berbahan dasar kaca.
Autoklaf (panas basah)	Medium pertumbuhan bakteri, aquades
Pasteurisasi	Susu
Radiasi sinar UV	Jas laboratorium,  permukaan interior laminar air flow ( BSC= biological safety cabinet)
Penambahan antibiotik ke  dalam medium	vaksin

           

 D. Pengujian keberhasilan sistem sterilisasi yang digunakan dapat dilakukan melalui beberapa teknik antara lain:

                -  uji reduktase biru metilen (Methylen Blue Reduction Test) .

        Test ini digunakan untuk menguji kualitas susu. Di dalam susu segar terdapat enzim reduktase yang dibentuk oleh mikrpba didalamnya yang dapat mereduksi zat warna indicator menjadi larutan tidak berwarna. Cara pengujiannya: susu dimasukkan ke dalam tabung yang sudah berisi indicator methylen blue, lalu dicampur dengan menutup tabung dan membolak-balikkan tabung sampai warna biru tersebar merata. Tabung tersebut dimasukkan kedalam penangas air (37 derajat Celsius) selama 5 menit untuk menghangatkan, setelah itu dimasukkan ke dalam incubator. Amati perubahan warna menjadi putih setelah beberapa waktu tertentu.

Waktu reduksi	Kualitas susu
0-20 menit	Jelek, diperkirakan mengandung bakteri lebih dari 20 juta/ml
20 menit – 2 jam	Kelas 3, diperkirakan mengandung bakteri 4-20 juta/ml
2 – 4,5 jam	Kelas 2, diperkirakan mengandung bakteri 0,5-4 juta/ml
4,5 – 5,5 jam	Kelas 1, diperkirakan mengandung bakteri kurang dari 0,5 juta/ml
Lebih dari 6 jam	Susu mengalami perlakuan (didihkan, ditambah atau mengandung antibiotika, ditambah disinfektan)

-          Uji sterilitas secara Direct inoculation of culture medium (inokulasi langsung) dengan media tioglikolat cair yang mengandung glukosa dan Na Tioglikolat untuk pembiakkan dalam kondisi aerob pada suhu inkubasi 31 derajat celsius.

Uji sterilisasi terhadap sediaan kloramfenikol

1.    Diambil sediaan sebanyak 1 ml menggunakan spuit injeksi yang steril

2.    Diinokulasikan dalam tabung reaksi berisi media tioglikolat cair.

3.    Pengerjaan dilakukan secara aseptis.

4.    Mulut tabung reaksi disumbat dengan menggunakan kapas

5.    Diinkubasi pada suhu 31 derajat Celsius selama 7 hari

6.    Pertumbumbuhan diamati pada media secara visual sesering mungkin sekurangnya pada hari ke3 atau ke-5, pada hari ke-7 (hari terakhir dari masa uji)

7.    Diamati kekeruhanmedia. Jika keruh, kemungkina terdapatnya mikroba.

Uji sterilitas terhadap sediaan injeksi vitamin (vitamin C)

1.    Diambil sediaan sebanyak 1 ml menggunakna spuit injeksi yang steril

2.    Diinokulasikan dalam tabunh reaksi berisi media tioglikolat cair

3.    Pengerjaan dilakukan secara aseptis

4.    Mulut tabung reaksi disumbat denganmenggunakan kapas

5.    Diinkubasi pada suhu 31 derajat Celsius selama 7 hari

6.    Pertumbumbuhan diamati pada media secara visual sesering mungkin sekurangnya pada hari ke3 atau ke-5, pada hari ke-7 (hari terakhir dari masa uji)

7.    Diamati kekeruhanmedia. Jika keruh, kemungkinan terdapatnya mikroba.

-          Uji resazurin untuk menentukan kualitas susu

Dasar dari uji ini yaitu kemampuan bakteriuntuk mereduksi warna. Pengujian dilakukan dengan memasukkan 10 ml sampel susu segar ke dalam tabung reaksi kemudian ditambah dengan 1 ml larutan resazurin 0,01% dan dipanaskan dalam water bath selama 30 menit. Selanjutnya contoh susu tersebut dibandingkan dengan blanko dalam alat pembanding warna yang mempunyai skala 0-6. Diamati perubahan warna yang terjadi dan ditentukan kualitasnya, jika susu berwarna biru dapat dinyatakan susu tersebut memiliki kualitas bagus karena semakin sedikit bahkan tidak adanya bakteri yang mereduksi resazurin. Sebaliknya, semakin memudarnya warna susu (menuju pink), dapat dinyatakan susu  tersebut berkualitas buruk karena semakin banyak bakteri yang mereduksi resazurin.

Daftar Pustaka:

Campbell & Reece. 2010. Biologi Edisi ke 8. Jakarta: Erlangga.

Retnoningrum, Debbie S. 2010. Prinsip Teknologi DNA Rekombinan. Bandung: Sekolah Farmasi ITB

Todar, Kenneth. 2008. Regulasi dan Kontrol Metabolisme Pada Bakteri. www.textbookofbacteriology.net. di akses 30 desember 2011   11.00 wib

Wibowo, Marlia Singgih. 2011. Uji Sterilitas. Bandung: Sekolah Farmasi ITB

Yuwono, T. 2005. Biologi Molekular. Jakarta: Erlangga.